草鱼、彩鲤的分子育种技术与新品种培育

1、草鱼分子育种技术与新品种培育

（1）草鱼基础研究情况

①草鱼生长相关基因IGF-2的克隆和功能研究

IGF-2是胰岛素样生长因子家族的重要成员，它能促进细胞的有丝分裂和分化，与鱼类胚胎发育和成体生长紧密相关。在哺乳动物仅中存在一个IGF-2基因，而斑马鱼中却存在两个重复的IGF-2基因，即igf-2a和igf-2b。由于在其他硬骨鱼类中尚未发现存在igf-2b基因的报道，因此不能确定斑马鱼重复IGF-2基因与鱼类特有的第3次全基因组重复相关。通过RACE方法，我们获得了草鱼IGF-2a和IGF-2b基因的cDNA全长序列，两序列长分别为2076bp和1692bp。和他们的人类同源基因一样，草鱼IGF-2a和IGF-2b mRNAs编码两个不同结构的成熟IGF多肽，包括B、C、A和D四个区域。对IGF-2a和IGF-2b mRNAs不同胚胎时期RT-PCR分析结果表明它们具有不同的表达模式。原位杂交结果显示IGF-2bmRNA在整个胚胎中都有表达，而IGF-2a mRNA则仅在脊索和脑中表达。在成年草鱼中，IGF-2b mRNA在除鳃之外的所有组织中表达，而IGF-2a mRNA则仅在肝脏中表达。生长激素注射使肝细胞中IGF-2a和-2b的转录本水平上调。此外，肝脏中IGF-2a和IGF-2b mRNAs的表达量在2到6天的饥饿过程中明显下降，在恢复喂食后迅速回复。构建了重组表达载体pGEX-KG-IGF-2b，经条件优化，确定IGF-2b蛋白的最佳表达条件为30℃ 0.1mM IPTG诱导表达3hrs。我们的研究结果表明IGF-2重复基因可能在草鱼的生长发育起着即保守而又略有不同的作用。

②草鱼胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1) 的低氧胁迫应答和过表达功能

胰岛素样生长因子结合蛋白IGFBP-1(insulin-like growth factors binding protein 1)是胰岛素样生长因子结合蛋白家族的重要成员，是低氧环境中对IGF信号系统进行调控的关键因子。IGFBP1蛋白通过与胰岛素样生长因子(IGF)结合，调控IGF信号转导通路，调节包括躯体生长、发育以及机体低氧耐受等功能。IGFBP1基因在斑马鱼等模式生物中研究得比较多，然而在经济鱼类中研究少见。而草鱼作为我国产量最大的淡水养殖鱼类之一，其生长发育与耐氧机制的研究倍受关注，因此研究IGFBP1基因，揭示其对草鱼生长发育与耐氧的作用就显得尤为迫切。本文研究了草鱼在低氧胁迫和饥饿条件下IGFBP1的表达情况，以及在草鱼中进行了IGFBP1的过表达研究。结果如下：（1）在低氧胁迫下，处于胚胎期，25天仔鱼期和3月龄等草鱼早期的发育阶段中，正常组中没有IGFBP1的表达，而进行低氧诱导的鱼体中IGFBP1存在明显的表达；（2）对6月龄的草鱼进行饥饿处理，发现在饥饿条件下，草鱼肝脏中IGFBP1的表达水平明显高于正常组。（3）在1细胞期的草鱼胚胎中进行了IGFBP1mRNA的过表达研究，过表达IGFBP1基因的胚胎的生长明显变慢，其体节数明显减少，出膜后,胚胎的体长也有明显变短；进一步采用Myod, MyoG, Ntl, pax6b, krox20等5个与鱼体肌肉生长和神经系统发育相关的探针，对过表达IGFBP1基因的胚胎进行了原位杂交，进一步确认过表达IGFBP1基因会导致草鱼胚胎肌肉生长变慢，神经系统发育变缓。这些都说明IGFBP1基因在草鱼生长和低氧应答中起着重要作用。

③草鱼肌肉生长抑制素（myostatin, MSTN）克隆和过表达功能分析

肌肉生长抑制素（myostatin, MSTN）是抑制肌肉生长和发育的重要生长调控因子。本文通过cDNA末端快速扩增法（RACE）克隆了草鱼MSTN-1全长cDNA，其全长为2190bp，开放阅读框长度为1128bp，可编码375个氨基酸，C端具有9个保守的半胱氨酸残基和RIRR的蛋白酶水解位点。序列比对显示，草鱼MSTN-1与斑马鱼MSTN-1的相似度高达96%，存在很强的进化保守性。RT-PCR结果分析表明，该基因在草鱼胚胎发育过程的各时期均有表达，但在胚胎后期表达较高；其在不同组织中的表达量存在较大差别，在眼、脑、骨骼肌中表达量较高，在肝、脾、心中表达量相对较低，而在性腺、鳃、肾和肠中无表达。整胚原位杂交结果显示，该基因不同时期表达存在比较明显差异，在20hpf时期主要在脊索区域表达，28hpf时期则在头部和尾部有表达，36hpf时期在头部和脊索就较高的表达量。通过显微注射MSTN-1 反义mRNA至草鱼1-2细胞期胚胎，结果显示，MSTN
反义mRNA可导致草鱼体节发生期胚胎脊柱出现北部肌肉增生，出现双脊柱现象，肌肉发育畸形明显。而通过显微注射MSTN-1
mRNA至斑马鱼胚胎，导致胚胎发育异常，体节发育受到强烈抑制而不分化等现象，通过整胚原位杂交表明在11h时相，肌节处MyoD基因表达紊乱，导致肌节分化出现异常。

（2）草鱼良种选育

2009年为了保证ENU的诱变效果，对每批雄性的草鱼都注射3针，每针注射时间相隔一个星期。药品注射方式为，将1gENU用5ml酒精溶解后，再加入1ml pH为6.0的磷酸缓冲液，得到6ml的溶液，然后给每条雄草鱼注射3ml，每次注射2条。即最终相当于给每条雄性草鱼注射了0.5g的ENU。需注明的是，所选的3条草鱼，每条重10kg，且均采用胸腔注射的方式。为了区分打针后的草鱼，我们给打针的每条鱼还打了电子标签，并剪取胸鳍保存于95%的酒精中，方便后期监测其基因型的变化。每条鱼三针打完后，放入亲鱼池与其它亲鱼混养，等待到繁殖季节后再取出进行人工授精。2010年5月份，我们进行人工授精，获得ENU诱变突变体鱼苗约1000尾。目前，正在土池培育阶段，截至目前，未发现出血病危害，长势良好，抽样平均体重在500g左右。计划在后代中进行生长和抗逆性状突变体的筛选，并进行基因型选育。

2、彩鲤分子育种与新品种培育

（1）彩鲤基础研究情况

1） 生长相关性状的分子标记筛选

①遗传图谱构建与QTL定位

以5尾兴国红鲤（♂）与5尾荷包红鲤（♀）杂交的F₂群体为资源群体，利用378个AFLP标记与24个微卫星标记共402个标记进行遗传连锁图谱构建，所构建的图谱中涵盖50个连锁群，图谱中标记数369个，最长连锁群472.6 cM，总间隔数为319，标记的平均间隔数为15.24 cM。图谱总长度为5608.1cM，图谱预期长度7588.4cM，图谱覆盖率为73.9%。通过连锁分析，共获得了与全长、体长、体高、尾柄长和尾柄高6个生长相关性状的25个QTL，其中21个与AFLP标记连锁（2个与体重、1个与全长，3个与体长，6个与体高，7个与尾柄长，2个与尾柄高相关的QTL），4个与SSR标记连锁（2个与体重，1个与体长，1个与尾柄长），其LOD值为3.13－6.53，可解释表型变异的0.05%-61.40%。

②生长相关的分子标记筛选

利用开发的彩鲤微卫星引物对86个兴国红鲤（♂）与5尾荷包红鲤（♀）杂交的F₂进行基因型与生长相关性状的相关性分析，发现8个微卫星标记与鲤生长性状具有显著相关性。其中：标记CL021与全长及体长性状显著相关；标记CL041与6个表型性状（体重、全长、体长、体高、体宽、尾柄长和尾柄高）均显著相关；标记CL060与体重及体高性状显著相关；标记CL097与体长性状显著相关；标记CL121与除尾柄长以外的另5个性状显著相关；标记CL147、CL158与体高显著相关，CL167与全长及体长显著相关。CL021标记已定位在所构建的遗传连锁图谱的21号连锁群上且与体长相关，所解释的表型变异为14.71%。经Blast比对CL021标记可能位于多个基因的5’UTR区域，关于此基因的研究目前已进行到下游基因序列的获取阶段。

2）体色相关性状的分子标记筛选与基因克隆

①体色相关性状的分子标记筛选

应用1100条RAPD引物对五种体色彩鲤（“全红”、“大花”、“麻花”、“粉玉”和“粉花”）的观赏型F₅选育系进行基因组扫描，发现一个引物与“粉花”体色有高度的相关性，并将其进行了SCAR标记转化，此SCAR标记只在“粉花”体色中出现，而在其它体色中不出现。该成果已申请专利（专利申请号：200910197432.5）

②体色差异表达基因的SSH分析

应用抑制性杂减杂交（SSH）技术对“全红”与“粉玉”、“大花”与“全红”体色瓯江彩鲤的差异表达基因进行了筛选和分析，发现6条EST序列可能与鲤的体色相关。

③酪氨酸酶基因克隆

酪氨酸酶是黑色素形成关键酶，已完成了5种体色彩鲤的酪氨酸酶基因的克隆，正进行表达情况分析。

3）鲤肌肉组织cDNA文库构建与测序

构建了彩鲤肌肉转录组cDNA文库并进行测序。mRNA分离后制备成片段化的cDNA文库，通过Illumina
HiSeq^TM 2000 测序仪对cDNA文库高通量测序。（1）彩鲤测序后分别40,000,000读次，读序长度3,600,000,000核苷酸。（2）使用SOAPdenovo软件组装后，鲤鱼的Contig,
Scafford, Unigene的长度与数量见表7。

通过blastx将Unigene序列比对到蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG，得到与给定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，对该Unigene的蛋白功能注释信息。通过COG功能注释，彩鲤一般功能预测组Unigene数目分别约2400个，细胞骨架相关Unigene约400个。

通过GO功能注释，按基因功能分类能够注释到Gene ontology中的Unigene数目13836个，并分为三大功能类型：即细胞结构组成成分、分子生物学功能和生物学过程

4）彩鲤不同体色的转录组测序

         应用454测序技术，测定了“粉玉”和“大花”两种体色的皮肤转录子序列，发现“大花”差异表达（即“大花”中测得的转录子在“粉玉”中未出现）的Contig有27417个，而“粉玉”差异表达（即“粉玉”中测得的转录子在“大花”中未出现）的Contig有15102个，初步发现两种体色差异明显的SNP位点200个以上。目前正对数据进行分析中，

5) 选择压力分析

在标记辅助选择中，现在绝大多数应用标记是选择中性，需对使用标记进行选择压力分析，那些在基因内的标记或与相关基因连锁程度高的标记在标记辅助育种作用更大。以兴国红鲤、玻璃红鲤、荷包红鲤和建鲤为研究对象，研究微卫星位点的选择压力情况，发现5个微卫星位点在选育群体中存在显著的选择压力，其中一个在QTL分析中第30号连锁群上的CL029标记的选择压力最为显著，该连锁群存在2个体重、1个尾柄长性状的QTL，表明此标记与这些鲤的选育性状存在较明显的连锁，可能适用于标记辅助育种。

6) 鲤鱼、草鱼肌肉蛋白组成分析

分别采取彩鲤、草鱼躯干白肌、红肌和混合肌，利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对其肌肉蛋白组成进行了分离，考马斯亮蓝染色显带。结果：（1）鲤鱼、草鱼肌肉的蛋白组成较为复杂；（2）初步定性彩鲤、草鱼肌肉中肌球蛋白重链（myosin heavy chain，200KD）和肌动蛋白（actin，43KD）条带，其他条带未作定性判断；（3）发现了彩鲤、草鱼白肌与红肌肉均存在特异性条带。

（2） 彩鲤良种选育

① 观赏型彩鲤选育

        至2010年，五个观赏彩鲤配套选育系已选育至第六代（F6），各系体色纯合度在91.55－100%，育成了可用于观赏型彩鲤配套系育种的专门化材料。

② 生长食用型彩鲤选育

至2010年，5个生长食用型彩鲤选育系已选育至第五代（F5），一龄阶段生长速度比对照组高3.08－20.13%。日前正进行F5的二龄阶段的数据整理与处理工作。